خانه مشاوره سرمایه گذاری در شرایط آزمایشگاهی سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلولی: اصول ، مزایا و مضرات

در شرایط آزمایشگاهی سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلولی: اصول ، مزایا و مضرات

2022-05-30

سمیت سمیت یکی از مهمترین شاخص های ارزیابی بیولوژیکی در مطالعات آزمایشگاهی است. در شرایط آزمایشگاهی ، مواد شیمیایی مانند داروها و سموم دفع آفات دارای مکانیسم های سمیت سلولی مختلف مانند از بین بردن غشاهای سلولی ، پیشگیری از سنتز پروتئین ، اتصال برگشت ناپذیر به گیرنده ها و غیره برای تعیین مرگ سلولی ناشی از این خسارت ها ، نیاز به ارزان استسمیت سلولی کوتاه مدت و قابل تکرار و سنجش زنده ماندن سلول. سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلولی بر اساس عملکردهای مختلف سلول است. در حال حاضر طیف گسترده ای از سنجش سمیت سلولی در زمینه های سم شناسی و فارماکولوژی استفاده می شود. طبقه بندی های مختلفی برای این سنجش ها وجود دارد: (i) سنجش های محرومیت از رنگ ؛(ب) سنجش های رنگ سنجی ؛(iii) سنجش های فلورومتری ؛و (IV) سنجش های لومینومتریک. انتخاب روش مناسب در بین این سنجش ها برای به دست آوردن نتایج دقیق و قابل اعتماد مهم است. هنگام انتخاب سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلولی که در مطالعه مورد استفاده قرار می گیرد ، باید پارامترهای مختلفی مانند در دسترس بودن در آزمایشگاه در جایی که مطالعه انجام شود ، ترکیبات آزمایش ، مکانیسم تشخیص ، ویژگی و حساسیت در نظر گرفته شود. در این فصل ، اطلاعاتی در مورد سمیت سلولی و سنجش های زنده سازی در شرایط آزمایشگاهی ارائه می شود ، این سنجش ها طبقه بندی می شوند و از مزایا و مضرات آنها تأکید می شود. هدف از این فصل راهنمایی محقق علاقمند به این موضوع برای انتخاب روش مناسب برای مطالعه خود است.

کلید واژه ها

زنده ماندن سلولها
سمیت سمی
سنجش های آزمایشگاهی
مزایای
معایب

اطلاعات نویسنده

özlem sultan aslantürk *

گروه زیست شناسی ، دانشکده هنر و علوم ، پردیس مرکزی ، دانشگاه عدنان مندرس ، آدن ، ترکیه

*آدرس کلیه مکاتبات با: [email protected]. edu. tr

1. مقدمه

میزان زنده ماندن و/یا میزان تکثیر سلول ها شاخص های خوبی برای سلامت سلول هستند. عوامل فیزیکی و شیمیایی می توانند بر سلامت سلولی و متابولیسم تأثیر بگذارند. این عوامل ممکن است از طریق مکانیسم های مختلف مانند تخریب غشاهای سلولی ، جلوگیری از سنتز پروتئین ، اتصال برگشت ناپذیر به گیرنده ها ، مهار کشیدگی پلیدوکسینوکلئوتیدی و واکنش های آنزیمی باعث سمیت در سلول ها شود. به منظور تعیین مرگ سلولی ناشی از این مکانیسم ها ، نیاز به سمیت سلولی کوتاه مدت ، قابل اعتماد و قابل تکرار و سنجش های زنده ماندن سلول وجود دارد.

قابلیت زنده ماندن سلول های آزمایشگاهی و سمیت سلولی با سلولهای کشت شده به طور گسترده ای برای آزمایش سمیت سمیت مواد شیمیایی و غربالگری دارو استفاده می شود. استفاده از این سنجش ها طی سالهای اخیر مورد توجه قرار گرفته است. در حال حاضر ، این سنجش ها همچنین در تحقیقات انکولوژیک برای ارزیابی سمیت ترکیبی و مهار رشد سلول تومور در هنگام رشد دارو استفاده می شود. زیرا ، آنها سریع ، ارزان هستند و نیازی به استفاده از حیوانات ندارند. علاوه بر این ، آنها برای آزمایش تعداد زیادی نمونه مفید هستند. زنده ماندن سلول و سنجش سمیت سلولی بر اساس عملکردهای مختلف سلولی مانند نفوذپذیری غشای سلولی ، فعالیت آنزیم ، پایبندی سلول ، تولید ATP ، تولید آنزیم و فعالیت جذب نوکلئوتید انجام می شود [1].

در شرایط آزمایشگاهی سمیت سلولی و/یا قابلیت زنده ماندن سلولی دارای مزایایی مانند سرعت ، کاهش هزینه و پتانسیل اتوماسیون هستند و آزمایشات با استفاده از سلولهای انسانی ممکن است نسبت به برخی از آزمایشات حیوانات داخل بدن مرتبط باشد. با این حال ، آنها برخی از معایب دارند زیرا هنوز از نظر فنی به اندازه کافی پیشرفته نیستند ، برای جایگزینی آزمایشات حیوانات [2].

این مهم است که بدانید چه تعداد سلول زنده باقی مانده و/یا چه تعداد سلول در پایان آزمایش مرده اند. در حال حاضر طیف گسترده ای از سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلول در زمینه های سم شناسی و فارماکولوژی استفاده می شود. انتخاب روش سنجش در ارزیابی نوع تعامل بسیار مهم است [3].

2. طبقه بندی سمیت سمیت و سنجش زنده ماندن سلول

اگرچه طبقه بندی های مختلفی برای سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلول وجود دارد ، در این فصل ، این سنجش ها با توجه به انواع اندازه گیری نقاط پایانی (تغییرات رنگ ، فلورسانس ، لومینسانس و غیره) طبقه بندی می شوند.

محرومیت از رنگ: سنجش های آبی ، ائوزین ، کنگو قرمز ، اریتروزین B.

سنجش رنگ سنجی: سنجش MTT ، سنجش MTS ، سنجش XTT ، سنجش WST-1 ، سنجش WST-8 ، سنجش LDH ، سنجش SRB ، سنجش NRU و سنجش ویولت کریستال.

سنجش فلورومتری: سنجش Alamarblue و روش CFDA-AM.

سنجش های چراغ: روش ATP و سنجش زنده ماندن در زمان واقعی.

2. 1سنجش های محرومیت رنگ

نسبت سلولهای زنده در جمعیت سلولی را می توان به روشهای مختلف تخمین زد. ساده ترین و به طور گسترده استفاده یکی از روش ها ، روش محرومیت از رنگ است. در روش محرومیت از رنگ ، سلولهای زنده رنگها را از بین می برند ، اما سلولهای مرده آنها را حذف نمی کنند. اگرچه روش رنگ آمیزی بسیار ساده است ، اما روش تجربی تعداد زیادی از نمونه ها دشوار و وقت گیر است [4]. تعیین یکپارچگی غشایی از طریق روش محرومیت از رنگ امکان پذیر است. انواع مختلفی از این رنگها از جمله ائوزین ، کنگو قرمز ، اریتروزین B و Trypan Blue استفاده شده است [5 ، 6]. از رنگهای ذکر شده ، از Trypan Blue به طور گسترده ای استفاده شده است [7 ، 8 ، 9 ، 10].

در صورت استفاده از سنجش های محرومیت از رنگ ، عوامل زیر باید در نظر گرفته شوند (i) سلولهای آسیب دیده به طور کشنده توسط عوامل سمیت سلولی ممکن است چند روز برای از دست دادن یکپارچگی غشای خود نیاز داشته باشند ، (ب) سلولهای بازمانده ممکن است در این مدت به تکثیر خود ادامه دهند ، و (iii) برخیبه نظر نمی رسد که سلولهای آسیب دیده به طور مرگبار در پایان دوره کشت با رنگ رنگ آمیزی شوند ، زیرا ممکن است دچار تجزیه اولیه شوند. عوامل (ii) و (iii) ممکن است باعث دست کم گرفتن مرگ سلولی شود که نتایج سنجش بر اساس درصد بیان زنده ماندن باشد [11 ، 12 ، 13].

سنجش های محرومیت از رنگ مزایای منحصر به فردی برای آزمایش حساسیت به شیمیایی دارند. آنها نسبتاً ساده هستند ، به تعداد کمی از سلول ها نیاز دارند ، سریع هستند و قادر به شناسایی کشتار سلول در جمعیت سلول های بدون سیم هستند. تحقیقات بیشتر در مورد نقش احتمالی این سنجش ها در آزمایش حساسیت به شیمی درمانی ضروری است [11]. با این حال ، هیچ یک از این رنگها برای استفاده در کشت سلول های تک لایه توصیه نمی شود بلکه برای سلولهای موجود در سیستم تعلیق در نظر گرفته شده است. بنابراین سلولهای تک لایه ابتدا باید تریپسین شوند [6].

2. 1. 1. سنجش محرومیت رنگ آبی تریپان

این روش محرومیت از رنگ برای تعیین تعداد سلولهای زنده و/یا مرده در سیستم تعلیق سلول استفاده می شود. Trypan Blue یک مولکول بزرگ با بار منفی است. سنجش محرومیت از رنگ آبی Trypan بر اساس این اصل است که سلولهای زنده دارای غشای سلولی دست نخورده هستند که این رنگ را حذف می کنند ، در حالی که سلولهای مرده اینگونه نیستند. در این روش ، سلولهای چسبنده یا غیرمستقیم با رقیق سریال ترکیبات تست برای زمان های مختلف انکوبه می شوند. پس از درمان ترکیب ، سلول ها شسته و به حالت تعلیق در می آیند. سیستم تعلیق سلول با رنگ مخلوط شده و سپس از نظر بصری مورد بررسی قرار می گیرد تا مشخص شود سلولها از آن استفاده می کنند یا از آن استفاده می کنند. سلولهای زنده سیتوپلاسم روشنی خواهند داشت ، در حالی که سلولهای مرده سیتوپلاسم آبی خواهند داشت [14 ، 15]. تعداد سلولهای زنده و/یا مرده در هر واحد حجم توسط میکروسکوپ نوری به عنوان درصد سلولهای کنترل نشده درمان نشده تعیین می شود [15 ، 16].

مزایا: این روش ساده ، ارزان و شاخص خوبی از یکپارچگی غشای است [17] ، و سلولهای مرده در عرض چند ثانیه از قرار گرفتن در معرض رنگ به رنگ آبی رنگ هستند [18].

معایب: شمارش سلول به طور کلی با استفاده از هماسیومتر انجام می شود [19]. بنابراین ، شمارش خطاها (~10 ٪) ممکن است رخ دهد. خطاهای شمارش به پراکندگی ضعیف سلول ها ، از دست دادن سلول در حین پراکندگی سلول ، رقیق شدن نادرست سلول ها ، پر کردن نامناسب محفظه و وجود حباب های هوا در محفظه نسبت داده شده است [17].

در حالی که روش رنگ آمیزی بسیار ساده است ، پردازش تعداد زیادی از نمونه ها به طور همزمان دشوار است ، به ویژه در مواردی که زمان دقیق اثرات سمیت سلولی مترقی مورد نیاز است [4]. علاوه بر این ، از رنگ آمیزی آبی تریپان نمی توان برای تمایز بین سلولهای سالم و سلولهایی که زنده هستند اما عملکرد سلول را از دست می دهند ، استفاده کرد. بنابراین ، استفاده از آن برای آزمایش سمیت سمیت در شرایط آزمایشگاهی به اندازه کافی حساس نیست. یکی دیگر از ضررهای آبی تریپان ، اثر جانبی سمی این رنگ بر روی سلولهای پستانداران است [20].

2. 1. 2. سنجش محرومیت رنگ اریتروزین B

اریتروزین B ، همچنین به عنوان اریتروزین یا شماره 3 قرمز شناخته می شود ، در درجه اول به عنوان ماده رنگ آمیزی مواد غذایی استفاده می شود [20 ، 21]. اریتروزین B قبلاً به عنوان یک رنگ حیاتی برای شمارش سلولهای زنده معرفی شده است. اصل این روش محرومیت از رنگ شبیه به اصل سنجش محرومیت رنگ آبی Trypan است. اگرچه اریتروسین B یک رنگ حیاتی بیولوژیکی جایگزین برای شمارش سلول است. از آن برای شمارش سلولهای زنده یا مرده استفاده نمی شود.

مزایا: این مزایا از قبیل کم هزینه ، تطبیق پذیری و ایمنی زیستی دارد [20].

معایب: روش آن زمان بر و کار فشرده است. علاوه بر این، معایب بالقوه شامل آلودگی محفظه شمارش سلولی قابل استفاده مجدد، تغییرات نرخ پر شدن هموسیتومتر و تغییرات بین کاربر است [20].

2. 2. سنجش رنگ سنجی

اصل سنجش رنگ سنجی اندازه گیری یک نشانگر بیوشیمیایی برای ارزیابی فعالیت متابولیک سلول ها است. معرف های مورد استفاده در سنجش های رنگ سنجی، رنگی را در پاسخ به زنده ماندن سلول ها ایجاد می کنند که امکان اندازه گیری رنگ سنجی زنده بودن سلول را از طریق اسپکتروفتومتر فراهم می کند. سنجش های رنگ سنجی برای رده های سلولی چسبنده یا معلق قابل اجرا هستند، به راحتی انجام می شوند و نسبتاً مقرون به صرفه هستند [22، 23]. کیت های تجاری سنجش رنگ از چندین شرکت موجود است و به طور کلی روش های آزمایشی این سنجش ها در بسته های کیت موجود است.

2. 2. 1. سنجش MTT

سنجش MTT (3-(4،5-دی متیل تیازول-2-ایل)-2-5-دی فنیل تترازولیوم بروماید) یکی از رایج ترین روش های رنگ سنجی برای ارزیابی سمیت سلولی یا زنده ماندن سلولی است [24]. این روش اساساً زنده ماندن سلول را از طریق تعیین عملکرد میتوکندریایی سلول ها با اندازه گیری فعالیت آنزیم های میتوکندری مانند سوکسینات دهیدروژناز تعیین می کند [18]. در این روش، MTT توسط NADH به فرمازان بنفش کاهش می یابد. این محصول را می توان با جذب نور در طول موج مشخصی تعیین کرد.

مزایا: این روش بسیار برتر از روش‌های حذف رنگ ذکر شده قبلی است زیرا استفاده آسان، ایمن، تکرارپذیری بالایی دارد و به طور گسترده برای تعیین زنده‌مانی سلولی و آزمایش‌های سمیت سلولی استفاده می‌شود [18، 25].

معایب: فرمازان MTT در آب نامحلول است و کریستال های سوزنی شکل بنفش را در سلول ها تشکیل می دهد. بنابراین، قبل از اندازه گیری جذب، یک حلال آلی مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا ایزوپروپانول برای حل کردن کریستال ها مورد نیاز است. علاوه بر این، سمیت سلولی MTT فرمازان، حذف محیط کشت سلولی را از چاه های صفحه به دلیل شناور بودن سلول ها با سوزن های MTT فرمازان دشوار می کند و خطای چاه به چاه قابل توجهی را ارائه می دهد [18، 26].

آزمایش‌های کنترلی اضافی باید برای کاهش نتایج مثبت یا منفی کاذب که ناشی از تداخل پس‌زمینه به دلیل گنجاندن ذرات است، انجام شود. این تداخل می تواند منجر به تخمین بیش از حد بقای سلول شود. این اغلب می تواند با تفریق جذب پس زمینه سلول ها در حضور ذرات کنترل شود، اما بدون معرف های سنجش [18، 26].

2. 2. 2. سنجش MTS

سنجش MTS (5- (3-کربوکسی متیوکسی فنیل) -2- (4،5-دی متیل-تیازولی) -3- (4-سولفوفنیل) تترازولیوم ، سنجش نمک داخلی) یک روش رنگ سنجی است. این روش مبتنی بر تبدیل نمک تترازولیوم به یک فرمازان رنگی با فعالیت میتوکندری سلولهای زنده است. مقدار فرمازان تولید شده به تعداد سلول زنده در کشت بستگی دارد و می توان با اسپکتروفتومتر در 492 نانومتر اندازه گیری کرد.

مزایا: مطالعات قبلی حاکی از آن است که سنجش سمیت سلولی در شرایط آزمایشگاهی ، تمام ویژگی های یک سیستم اندازه گیری خوب را از نظر سهولت استفاده ، دقت و نشانه سریع سمیت ترکیب می کند [27 ، 28]. سنجش MTS یک روش سریع ، حساس ، اقتصادی و خاص در شرایط آزمایشگاهی سمیت سمی است. عملکرد این روش با سایر آزمایشات سم شناسی بسیار رقابتی است. این روش خواص ایده آل برای اندازه گیری سمیت سلولی را فراهم می کند زیرا استفاده از آن آسان است ، سریع ، قابل اعتماد و ارزان است. بنابراین ، می توان از آن برای ارزیابی های سم شناسی در محل استفاده کرد [27 ، 29 ، 30 ، 31].

معایب: میزان جذب اندازه گیری شده در 492 نانومتر تحت تأثیر زمان جوجه کشی ، نوع سلول و تعداد سلول است. نسبت معرفهای تشخیص MTS به سلول ها در کشت نیز بر میزان جذب اندازه گیری شده تأثیر می گذارد. مطالعات قبلی حاکی از رابطه خطی بین زمان جوجه کشی و جذب برای زمان جوجه کشی کوتاه تا 5 ساعت است [29 ، 32 ، 33]. بنابراین ، زمان جوجه کشی مناسب برای این روش 1-3 ساعت است.

2. 2. 3. سنجش XTT

یک روش رنگ سنجی مبتنی بر نمک تترازولیوم XTT (2،3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulphophenyl) -5-carboxanilide-2H-tetrazolium ، نمک مونوسودیوم) برای اولین بار توسط Scudiero و همکاران شرح داده شد.[34]در حالی که MTT یک ترکیب فرمازان محلول در آب تولید می کند که به منظور اندازه گیری میزان جذب آن نیاز به حل رنگ دارد ، XTT یک رنگ محلول در آب تولید می کند. روش XTT به سادگی برای اندازه گیری تکثیر است و بنابراین یک راه حل عالی برای اندازه گیری سلول ها و تعیین زنده ماندن آنها است. XTT برای سنجش تکثیر سلولی به عنوان پاسخ به عوامل رشد مختلف استفاده می شود. همچنین برای سنجش سمیت سمیت استفاده می شود.

این روش بر اساس کاهش توانایی نمک تترازولیوم XTT به ترکیبات فرمازان به رنگ نارنجی توسط سلولهای فعال متابولیک است. فرماز به رنگ نارنجی محلول در آب است و شدت آن را می توان با یک اسپکتروفتومتر اندازه گیری کرد. رابطه خطی بین شدت فرمازان و تعداد سلولهای زنده وجود دارد. استفاده از صفحات multiwell و یک اسپکتروفتومتر (یا ELISA Reader) امکان مطالعه با تعداد زیادی نمونه و به دست آوردن نتایج را به راحتی و سریع فراهم می کند. روش این روش شامل کشت سلولی در یک صفحه 96 چاه است و معرف XTT و جوجه کشی را به مدت 2-24 ساعت اضافه می کند. در زمان جوجه کشی ، یک رنگ نارنجی تشکیل می شود و شدت رنگ را می توان با یک اسپکتروفتومتر اندازه گیری کرد [34 ، 35].

مزایا: روش XTT سرعت ، حساس ، آسان برای استفاده و روش ایمن است. حساسیت و دقت بالایی دارد [35].

معایب: عملکرد سنجش XTT به ظرفیت کاهنده سلولهای زنده با فعالیت دهیدروژناز میتوکندری بستگی دارد. بنابراین ، تغییر ظرفیت کاهنده سلولهای زنده ناشی از تنظیم آنزیمی ، pH ، غلظت یون سلولی (به عنوان مثال ، سدیم ، کلسیم ، پتاسیم) ، تغییر چرخه سلولی یا سایر عوامل محیطی ممکن است بر خواندن جذب نهایی تأثیر بگذارد [34 ، 35].

2. 2. 4. سنجش WST-1

WST-1 (2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2،4-disulfophenyl) -2 H Tetrazolium Salt Salt)) روش تکثیر سلولی یک روش ساده و رنگی است که برای اندازه گیری نسبی طراحی شده استمیزان تکثیر سلول ها در کشت. اصل این روش مبتنی بر تبدیل نمک تترازولیوم WST-1 به یک فرمازان محلول در آب توسط آنزیم های دهیدروژناز میتوکندری در حضور پذیرنده الکترون میانی ، مانند MPM ها (1-متیوکسی-5 متیل-فنرازینیوم متیل متیل است. سولفات) [36]. نمک محلول در آب به محیط کشت سلول آزاد می شود. در دوره جوجه کشی ، واکنش یک تغییر رنگ ایجاد می کند که به طور مستقیم با میزان دهیدروژناز میتوکندری در کشت سلول متناسب است و بنابراین ، سنجش فعالیت متابولیکی سلول ها را اندازه گیری می کند.

برای انجام سنجش ، معرف WST-1 که آماده استفاده است ، مستقیماً به رسانه سلولهای کشت شده در صفحات چندگانه اضافه می شود. سپس به کشتها 30 دقیق ه-4 ساعت داده می شود تا معرف به فرم رنگ کاهش یابد. سپس صفحه بلافاصله در 450 نانومتر با خواندن مرجع در 630 نانومتر خوانده می شود [37].

مزایا: استفاده از آن آسان است ، ایمن ، از تکرارپذیری بالایی برخوردار است و به طور گسترده ای برای تعیین زنده ماندن سلولی و آزمایش سمیت سمیت استفاده می شود. علاوه بر این ، شاخص های قرمز فنل در محیط کشت سلولی در واکنش رنگ تداخل ندارند. از آنجا که رنگ رنگی که در انتهای آزمایش تولید می شود محلول در آب است ، به یک حلال و زمان جوجه کشی اضافی احتیاج ندارد [37].

معایب: زمان جوجه کشی استاندارد زمان WST-1 2 ساعت است. این که آیا افزودن یک بار WST-1 می تواند تأثیر عوامل آزمایش را در نقاط زمانی مختلف بر روند زنده ماندن سلول نسبی منعکس کند ، هنوز مشخص نیست [37].

2. 2. 5. سنجش WST-8

سنجش WST-8 یک روش رنگی برای تعیین تعداد سلول های زنده است و می تواند برای سنجش تکثیر سلولی و همچنین سنجش سمیت سمیت استفاده شود. WST-8 (2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2،4-disulfophenyl) -2 H tetrazolium ، نمک مونوسودیوم) ، یک WST بسیار پایدار و محلول در آب، در کیت شمارش سلول (CCK-8) استفاده می شود. این حساس تر از WST-1 به ویژه در pH خنثی است [37]. به دلیل واسطه الکترون ، PM های 1 متیوکسی در این کیت بسیار پایدار است و CCK-8 حداقل 6 ماه در دمای اتاق و به مدت 1 سال در 0-5 درجه سانتیگراد پایدار است. 8 فرمازان ، و PM های 1-متیوکسی هیچ گونه سمیت سمیت روی سلول ها در محیط کشت ندارند ، ممکن است سلولهای مشابه از روش قبلی برای آزمایش های اضافی استفاده شوند.

مزایا: WST-8 قابل نفوذ سلول نیست ، که منجر به سمیت سلولی کم می شود. بنابراین ، پس از سنجش ، می توان آزمایش های بیشتر را با استفاده از همان سلول ها ادامه داد. علاوه بر این ، فرماز محلول در آب را پس از کاهش سلولی تولید می کند ، که با اجازه یک روش سنجش ساده تر ، یک مزیت اضافی را برای این روش فراهم می کند و برای حل فرمازان به یک قدم اضافی احتیاج ندارد [28].

معایب: نکته مهم این است که کاهش بسترهای سنجش با تغییر در فعالیت متابولیکی داخل سلولی که هیچ تأثیر مستقیمی در زنده ماندن سلول ندارد ، تأثیر می گذارد [15].

2. 2. 6. روش LDH (لاکتات دهیدروژناز)

روش سمیت سمیت سمیت سلولی LDH (لاکتات دهیدروژناز) یک روش رنگی برای سنجش سمیت سلولی سلولی است. کیت سنجش سمیت سمیت سمیت LDH می تواند با انواع مختلف سلول ها نه تنها برای سنجش سمیت سلولی با واسطه سلول بلکه برای ارزیابی سمیت سمیت واسطه توسط مواد شیمیایی سمی و سایر ترکیبات آزمایش استفاده شود. سنجش آنزیم پایدار ، سیتوزولی ، لاکتات دهیدروژناز (LDH) را از نظر کمی اندازه گیری می کند. این آنزیم از سلولهای آسیب دیده منتشر می شود. LDH آنزیمی است که به طور معمول در سیتوپلاسم سلول یافت می شود. هنگامی که زنده ماندن سلول باعث کاهش نشت غشای پلاسما می شود و بنابراین آنزیم LDH به محیط کشت سلول آزاد می شود. LDH آزاد شده با یک واکنش آنزیمی همراه اندازه گیری می شود که منجر به تبدیل نمک تترازولیوم (یدونیتروتترازولیوم (INT)) به یک فرمازان رنگ قرمز توسط دیافوراس می شود. در مرحله اول ، LDH تبدیل لاکتات به پیروات را کاتالیز می کند و بنابراین NAD به NADH/H + کاهش می یابد. در مرحله دوم ، کاتالیزور (دیافوراز) H/H + از NADH/H + به نمک تترازولیوم 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-فنیل تترازولیوم (Int) منتقل می شود ، که کاهش می یابد. به قرمز فرمازان [38 ، 39].

فعالیت LDH به عنوان اکسیداسیون NADH یا کاهش int در یک دوره زمانی مشخص تعیین می شود. فرمازان قرمز حاصل حداکثر در 492 نانومتر جذب می شود و می تواند کمی در 490 نانومتر اندازه گیری شود.

مواد شوینده تریتون X-100 معمولاً به عنوان کنترل مثبت در روش LDH برای تعیین حداکثر انتشار LDH از سلول ها استفاده می شود. علاوه بر این ، ذرات غشای شناخته شده مانند سیلیس کریستالی می توانند به عنوان یک کنترل مثبت در روش LDH استفاده شوند [40].

مزایا: قابلیت اطمینان ، سرعت و ارزیابی ساده برخی از ویژگی های این روش است. زیرا ، از دست دادن LDH داخل سلولی و انتشار آن به محیط کشت ، نشانگر مرگ سلول برگشت ناپذیر به دلیل آسیب غشای سلولی است [38 ، 41].

معایب: محدودیت اصلی این روش این است که سرم و برخی ترکیبات دیگر دارای فعالیت ذاتی LDH هستند. به عنوان مثال، سرم جنین گوساله دارای خوانش پس زمینه بسیار بالایی است. بنابراین، این سنجش محدود به شرایط بدون سرم یا سرم کم است، دوره کشت سنجش را محدود می‌کند (بسته به تحمل سلول‌های شما به سرم کم) و دامنه سنجش را کاهش می‌دهد، زیرا دیگر نمی‌تواند امکان تعیین مرگ سلولی ناشی از آن را فراهم کند. تحت شرایط رشد طبیعی (یعنی در 10٪ سرم جنین گوساله). حداقل، همیشه باید ابتدا سنجش را با مقداری از رسانه‌ای که قصد استفاده از آن را استفاده نکرده‌اید آزمایش کنید و قرائت را با آنهایی که از رسانه‌های فاقد مکمل‌ها (مانند DMEM مستقیم) استفاده می‌شود، مقایسه کنید [42].

2. 2. 7. سنجش SRB (سولفورودامین B).

سنجش SRB (سولفورودامین B) یک روش رنگ سنجی سریع و حساس برای اندازه گیری سمیت سلولی ناشی از دارو در هر دو کشت سلولی متصل و سوسپانسیون است. این سنجش همانطور که برای اولین بار توسط Skehan و همکارانش توضیح داده شد برای استفاده در برنامه کشف داروی ضد سرطانی در مقیاس بزرگ موسسه ملی سرطان (NCI) که در سال 1985 راه اندازی شد، توسعه داده شد. SRB یک رنگ آمینوگزانتین صورتی روشن با دو سولفونیک است. گروه ها. تحت شرایط اسیدی خفیف، SRB به باقی مانده های اسید آمینه پایه پروتئین در سلول های ثابت شده با TCA (اسید تری کلرواستیک) متصل می شود تا شاخص حساسی از پروتئین سلولی را ارائه دهد. سنجش SRB همچنین برای ارزیابی تشکیل کلنی و انقراض کلنی استفاده می شود [43].

مزایا: سنجش SRB ساده، سریع و حساس است. این خطی بودن خوبی با تعداد سلول ارائه می دهد، استفاده از غلظت رنگ اشباع را مجاز می کند، نسبت به نوسانات محیطی حساسیت کمتری دارد، مستقل از متابولیسم واسطه است، و نقطه پایانی ثابتی را ارائه می دهد که نیازی به اندازه گیری حساس به زمان سرعت واکنش اولیه ندارد [43].]. تکرارپذیری این روش بالا است.

معایب: به دست آوردن و حفظ یک سوسپانسیون سلولی همگن مهم است. برای عملکرد بالای سنجش باید از توده ها/انبوه های سلولی اجتناب شود.

2. 2. 8. سنجش NRU (جذب قرمز خنثی).

روش جذب خنثی قرمز (NRU) همچنین یکی از پرکاربردترین روش سمیت سمی رنگ سنجی/سنجش زنده ماندن سلول است. این روش توسط Borenfreund و Puerner ساخته شده است [44]. این روش بر اساس توانایی سلولهای زنده در گرفتن رنگ قرمز خنثی رنگ فوق العاده بود. این رنگ ضعیف کاتیونی با انتشار منفعل غیرونیک و کنسانتره در لیزوزوم ها ، به غشاهای سلولی نفوذ می کند. سپس رنگ با استفاده از محلول اتانول اسیدی از سلولهای زنده استخراج می شود و جذب رنگ با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود.

جذب قرمز خنثی به ظرفیت سلول ها برای حفظ شیب pH از طریق تولید ATP بستگی دارد. در pH فیزیولوژیکی ، بار خالص رنگ صفر است. این بار رنگ را قادر می سازد تا به غشای سلولی نفوذ کند. در داخل لیزوزومها ، یک شیب پروتون برای حفظ pH پایین تر از سیتوپلاسم وجود دارد. بنابراین ، رنگ شارژ می شود و در داخل لیزوزومها حفظ می شود. هنگامی که سلول می میرد یا شیب pH کاهش می یابد ، رنگ نمی تواند حفظ شود. علاوه بر این ، جذب قرمز خنثی توسط سلولهای زنده می تواند با تغییر در سطح سلول یا غشاهای لیزوزومی اصلاح شود. بنابراین ، می توان بین سلولهای زنده ، آسیب دیده یا مرده تمایز قائل شد [44]. جذب لیزوزومی رنگ قرمز خنثی یک شاخص بسیار حساس از زنده ماندن سلول است. این روش می تواند زنده ماندن سلول را اندازه گیری کرده و تکثیر سلول ، اثرات سیتوستاتیک یا اثرات سمیت سلولی را بسته به چگالی بذر اندازه گیری کند [45]. جذب در 540 نانومتر در اسپکتروفتومتر خواننده صفحه چندگانه اندازه گیری می شود.

مزایا: سنجش NRR نشانگر خوبی از آسیب لیزوزومی است. همچنین ، سرعت و ارزیابی ساده برخی از مزایای این روش است.

معایب: گزارش شده است که سنجش NRR یا حداقل یا اصلاً تحت تأثیر عوامل طبیعی مانند دما و شوری قرار دارد ، اما عمدتاً تحت تأثیر آلاینده ها است [46].

2. 2. 9. سنجش CVS (سنجش کریستال بنفش)

سلولهای چسبنده از صفحات کشت سلولی در هنگام مرگ سلولی جدا می شوند. این ویژگی می تواند برای ارزیابی غیرمستقیم مرگ سلولی و تعیین تفاوت در میزان تکثیر بر تحریک با عوامل سمیت سلولی استفاده شود. یک روش ساده برای تشخیص پایبندی حفظ شده سلولها ، سنجش کریستالی بنفش است. در این روش ، رنگ بنفش کریستال به پروتئین ها و DNA سلولهای زنده متصل می شود و بنابراین ، سلولهای متصل با این رنگ رنگ آمیزی می شوند. سلولها در هنگام مرگ سلولی پایبندی خود را از دست می دهند و متعاقباً از جمعیت سلول ها گم می شوند و میزان رنگ آمیزی بنفش کریستال را در یک کشت کاهش می دهند. سنجش کریستال بنفش یک روش غربالگری سریع و قابل اعتماد است که برای بررسی تأثیر شیمی درمانی یا سایر ترکیبات بر بقای سلول و مهار رشد مناسب است [47].

مزایا: رنگ آمیزی کریستال بنفش یک روش سریع و همه کاره برای غربالگری زنده ماندن سلول در شرایط تحریک متنوع است [48]. با این حال ، این به طور بالقوه با پاسخ های تکثیر کننده که همزمان با پاسخ های مرگ سلولی رخ می دهد ، به خطر می افتد. بنابراین ، مهار کننده های شیمیایی کاسپازها و/یا نكروپتوز ممکن است در روش گنجانیده شوند [49 ، 50]. از طرف دیگر ، مطالعات مولکولی (به عنوان مثال ، بیان بیش از حد یا حذفی) می تواند به طور خاص به ماهیت مرگ سلولی بپردازد [51].

معایب: سنجش بنفش کریستال نسبت به تغییرات در فعالیت متابولیک سلولی حساس نیست. بنابراین ، این روش برای مطالعات استفاده شده از ترکیبات متابولیسم سلولی مناسب نیست. در حالی که سنجش بنفش کریستال برای بررسی تأثیر شیمی درمانی یا سایر ترکیبات بر بقای سلول و مهار رشد مناسب است ، اما قادر به اندازه گیری میزان تکثیر سلولی نیست [51].

2. 3سنجش های فلورومتری

سنجش های فلورومتری زنده ماندن سلول و سمیت سلولی با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس ، فلوئورومتر ، میکروپلیت فلورسانس یا فلوسیتومتر جریان آسان است و آنها مزایای بسیاری را نسبت به محرومیت از رنگ سنتی و سنجش های رنگی ارائه می دهند. سنجش های فلورومتری نیز برای رده های سلولی چسبنده یا معلق و استفاده آسان قابل استفاده است. این سنجش ها نسبت به سنجش های رنگ سنجی حساس تر هستند [52 ، 53 ، 54]. کیت های تجاری سنجش های فلورومتری از چندین شرکت در دسترس است و به طور کلی رویه های تجربی این سنجش ها در بسته های کیت موجود است.

2. 3. 1. سنجش alamarblue (ab)

سنجش Alamarblue همچنین به عنوان روش کاهش Resazurin شناخته می شود. روش alamarblue بر اساس تبدیل resazurin رنگ آبی غیر فلورسنت آبی است که توسط میتوکندری و آنزیم های دیگر مانند دیافورازها به رزورفین فلورسنت صورتی تبدیل می شود [53].

Resazurin یک نشانگر Redox با رنگ 3 فنوکازازین 3-یک و سلول است که می تواند برای نظارت بر تعداد سلول های زنده با پروتکل های مشابه با استفاده از ترکیبات تترازولیوم استفاده شود [55]. شناخته شده است که به عنوان یک پذیرنده الکترون میانی در زنجیره حمل و نقل الکترون بین کاهش نهایی اکسیژن و سیتوکروم اکسیداز با جایگزینی اکسیژن مولکولی به عنوان گیرنده الکترون عمل می کند [52]. این یک ترکیب غیر سمی و قابل نفوذ سلول است. رنگ این ترکیب آبی است و غیر فلورسنت است. پس از ورود به سلول ها ، resazurin به resorufin کاهش می یابد. Resorufin از نظر رنگ قرمز و ترکیب بسیار فلورسنت است. سلولهای زنده به طور مداوم resazurin به resofurin تبدیل می شوند و فلورسانس کلی و رنگ محیط کشت سلول را افزایش می دهند. مقدار رزوفورین تولید شده به تعداد سلولهای زنده مربوط می شود. نسبت سلولهای زنده را می توان با استفاده از یک فلورومتریکر خواننده میکروپلیت مجهز به مجموعه فیلتر انتشار 560 نانومتر/590 نانومتر اندازه گیری کرد. Resofurin همچنین می تواند با تغییرات جذب اندازه گیری شود ، اما تشخیص جذب اغلب مورد استفاده قرار نمی گیرد زیرا تشخیص جذب نسبت به اندازه گیری فلورسانس حساسیت کمتری دارد.

دوره جوجه کشی مورد نیاز برای تولید سیگنال فلورسنت کافی بالاتر از پس زمینه معمولاً حدود 1-4 ساعت است ، بسته به فعالیت متابولیکی سلول ها ، چگالی سلول در هر چاه و سایر شرایط مانند نوع متوسط کشت [54].

مزایا: روش Alamarblue (کاهش resazurin) نسبتاً ارزان و حساس تر از سنجش تترازولیوم است. همچنین ، می توان با روش های دیگر مانند اندازه گیری فعالیت کاسپاز برای جمع آوری اطلاعات بیشتر در مورد مکانیسم سمیت سمیت ، چند برابر شد.

معایب: تداخل فلورسنت از ترکیبات آزمایش و اثرات سمی مستقیم غالباً نادیده گرفته شده بر روی سلول ها امکان پذیر است [54].

2. 3. 2. سنجش CFDA-AM

CFDA-AM (5-کربوکسی فلوئورسئین دیاستات ، استوکس متیل استر) یکی دیگر از رنگهای فلوروژن است که برای تعیین سمیت سمیت استفاده می شود. این شاخص برای یکپارچگی غشای پلاسما است. رنگ CFDA-AM بستر غیر سمی استراز است که می تواند توسط استراس غیر اختصاصی سلولهای زنده از یک ماده نفوذ پذیر ، غیر قطبی ، غیر فلورسانس به قطبی ، فلورسنت ، کربوکسی فلوئورسئین (CF) تبدیل شود. تبدیل CFDA-AM به CF توسط سلول ها نشانگر یکپارچگی غشای پلاسما است ، زیرا تنها یک غشای دست نخورده می تواند محیط سیتوپلاسمی را که برای حمایت از فعالیت استراز مورد نیاز است ، حفظ کند [56].

مزایا: سنجش CFDA-AM و Alamarblue به طور موازی در همان مجموعه سلول ها قابل استفاده است ، زیرا هر دو نسبت به سلول ها غیر سمی هستند ، به زمان جوجه کشی مشابه نیاز دارند و می توانند در طول موج های مختلف و بدون دخالت شناسایی شوند [56 ، 57 ، 58].

معایب: تداخل فلورسنت از ترکیبات آزمایش امکان پذیر است.

2. 3. 3. سنجش نشانگر زنده ماندن پروتئاز (سنجش GF-AFC)

اندازه گیری فعالیت آنزیم پروتئاز محافظت شده و سازنده سلولهای زنده به عنوان شاخص خوبی از زنده ماندن سلول استفاده می شود. یک بستر پروتئاز فلوروژن قابل نفوذ سلول (گلیسییل فنیلنیلنیل-آمینوفلووروکومارین ؛ GF-AFC) اخیراً برای تشخیص انتخابی فعالیت پروتئاز که محدود به سلولهای زنده است ، ایجاد شده است [59]. بستر GF-AFC می تواند به سلولهای زنده نفوذ کند. در این سلولها ، فعالیت آمینوپپتیداز سیتوپلاسمی اسیدهای آمینه GLY و PHE را برای آزاد کردن آمینوفلووروکومارین (AFC) از بین می برد و یک سیگنال فلورسنت متناسب با تعداد سلولهای زنده تولید می کند [54].

هنگامی که سلول ها می میرند ، این فعالیت پروتئاز به سرعت از دست می رود. بنابراین ، این فعالیت پروتئاز یک نشانگر انتخابی از جمعیت سلولهای زنده است. سیگنال حاصل از این روش سنجش نشان داده شده است که به خوبی با سایر روشهای تعیین شده برای تعیین زنده ماندن سلول مانند روش ATP ارتباط دارد [54].

مزایا: برای سلول ها در کشت نسبتاً غیر سمی است. همچنین ، در مقابل قرار گرفتن در معرض سلولها به تترازولیوم ، قرار گرفتن در معرض طولانی مدت سلولهای بستر GF-AFC منجر به تغییر کمی در زنده ماندن سلول ها می شود. این روش برای چند برابر شدن با سایر سنجش ها مناسب است ، زیرا در پایان سنجش ، جمعیت سلولی قابل دوام است و می تواند برای سنجش های بعدی مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این ، زمان جوجه کشی در مقایسه با 1-4 ساعت مورد نیاز برای سنجش تترازولیوم بسیار کوتاهتر (30 دقیقه-1 ساعت) است [54].

معایب: تداخل فلورسنت از ترکیبات آزمایش امکان پذیر است.

2. 4سنجش های چراغی

سنجش های لومینومتریک تعیین سریع و ساده تکثیر سلولی و سمیت سلولی در سلولهای پستانداران را فراهم می کند. این سنجش ها را می توان در قالب صفحه مناسب 96 چاه و 384 چاه و تشخیص توسط میکروپلیت لومینومتریک انجام داد [54 ، 60 ، 61]. یک ویژگی قابل توجه از سنجش های لومینومتریک سیگنال از نوع درخشش مداوم و پایدار تولید شده پس از افزودن معرف است. این ویژگی را می توان برای تولید هر دو مقدار زنده ماندن و سمیت سلولی از همان چاه استفاده کرد [59]. کیت های تجاری سنجش های لومینومتریک از چندین شرکت در دسترس است و به طور کلی رویه های تجربی این سنجش ها در بسته های کیت موجود است.

2. 4. 1. سنجش ATP

ATP (آدنوزین تری فسفات) مهمترین مخزن انرژی شیمیایی در سلول ها را نشان می دهد و برای سنتز بیولوژیکی ، سیگنالینگ ، حمل و نقل و فرآیندهای حرکتی استفاده می شود. بنابراین ، ATP سلولی یکی از حساس ترین نقاط در اندازه گیری زنده ماندن سلول است [62]. هنگامی که سلولها به طور مرگبار آسیب دیده و یکپارچگی غشایی را از دست می دهند ، توانایی سنتز ATP را از دست می دهند و سطح ATP سلول ها به طرز چشمگیری کاهش می یابد [54 ، 63]. روش ATP بر اساس واکنش لوسیفرین به اکسیلوسیفرین است. آنزیم لوسیفراز این واکنش را در حضور یونهای منیزیم 2+ و ATP که دارای یک سیگنال درخشان است ، کاتالیز می کند. رابطه خطی بین شدت سیگنال درخشان و غلظت ATP [61] یا تعداد سلول [64] وجود دارد.

شیمی سنجش ATP به طور معمول می تواند کمتر از 10 سلول را در هر چاه تشخیص دهد ، بنابراین ، از قالب صفحه چاه 1536 استفاده شده است.

مزایا: سنجش ATP سریعترین سنجش زنده ماندن سلول برای استفاده ، حساس ترین است و نسبت به سایر سنجش های زنده ماندن مستعد ابتلا به مصنوعات است. سیگنال درخشان به حالت پایدار می رسد و در طی 10 دقیقه پس از افزودن معرف تثبیت می شود. این یک مرحله جوجه کشی برای تبدیل بستر به ترکیب رنگی ندارد. این همچنین یک مرحله انتقال صفحه را از بین می برد [54].

معایب: حساسیت سنجش ATP معمولاً با تکرارپذیری نمونه های تکرار لوله به جای نتیجه شیمی سنجش محدود می شود [54].

2. 4. 2. سنجش زنده ماندن در زمان واقعی

اخیراً ، یک روش جدید برای اندازه گیری تعداد سلول های زنده در زمان واقعی ایجاد شده است [60]. در این روش ، لوسیفراز مهندسی شده از میگو دریایی و از یک prosubstrate مولکول کوچک استفاده می شود. طرفدار زیرشاخه و لوسیفراز مستقیماً به عنوان یک معرف به محیط کشت سلول اضافه می شوند. ProStrate بستر لوسیفراز نیست. سلولهای زنده با یک متابولیسم فعال ، پیش بینی را به یک بستر ، که توسط لوسیفراز استفاده می شود ، برای تولید سیگنال درخشان کاهش می دهد. سنجش را می توان در دو قالب انجام داد: اندازه گیری مداوم خواندن و نقطه پایانی. در قالب خواندن مداوم ، سیگنال Luminescent می تواند به طور مکرر از چاههای نمونه در طی یک دوره طولانی ثبت شود تا تعداد سلول ها در "زمان واقعی" اندازه گیری شود [54 ، 60].

مزایا: این روش تنها سنجش است که به اندازه گیری زمان واقعی زنده ماندن سلول/سمیت سلولی امکان می دهد. کاهش سریع سیگنال درخشان به دنبال مرگ سلولی ، این روش را با سایر سنجش های درخشان که حاوی یک مرحله لیز است که باعث از بین رفتن سلول ها می شود ، چند برابر می کند. کاهش لومینسانس پس از مرگ سلولی برای از بین بردن تداخل در سنجش های درخشان متعاقب آن مهم است [54 ، 60].

معایب: محدودیتی از سنجش زمان واقعی ناشی از کاهش نهایی طرفدار بستر توسط سلولهای فعال متابولیکی است. به طور کلی ، سیگنال درخشان با تعداد سلولهای فعال متابولیکی ارتباط برقرار می کند. با این حال ، طول زمان سیگنال درخشان خطی با تعداد سلول به تعداد سلول ها در هر چاه و فعالیت متابولیک آنها بستگی دارد. بنابراین ، توصیه می شود که حداکثر زمان جوجه کشی برای حفظ خطی برای هر نوع سلول و چگالی بذر به صورت تجربی تعیین شود [54 ، 60].

3. نتیجه گیری

در حال حاضر طیف گسترده ای از سمیت سلولی و سنجش زنده ماندن سلول در زمینه های سم شناسی و فارماکولوژی استفاده می شود. یک روش ایده آل برای زنده ماندن آزمایشگاهی و/یا تعیین سمیت سمیت باید یک سریع ، ایمن ، قابل اعتماد ، کارآمد و زمان و مقرون به صرفه باشد. نباید در ترکیب آزمایش تداخل داشته باشد. انتخاب روش سنجش در ارزیابی نوع تعامل بسیار مهم است. روش ممکن است تفسیر تعامل مرکب را تغییر دهد. بنابراین ، با توجه به مکانیسم عملکرد ترکیب آزمایش ، روش سنجش باید با احتیاط انتخاب شود [3]. بافت یا نوع سلول مورد استفاده در مطالعه همچنین بر عملکرد سمیت سلولی و/یا سنجش زنده ماندن سلولی تأثیر می گذارد. بنابراین ، قبل از انتخاب یک روش برای مطالعه ، روش های مختلفی را باید امتحان و مقایسه کرد. در صورت امکان ، بیش از یک روش باید برای تعیین سمیت سلولی و/یا زنده ماندن سلولی در مطالعات آزمایشگاهی استفاده شود. بنابراین ، قابلیت اطمینان نتایج به دست آمده افزایش می یابد.